Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes

authors

Danaher et al.

journal

Journal for Immunotherapy of Cancer

year

2017

doi

10.1186/s40425-017-0215-8

category

transcriptomics

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업데이트

2026-07-31

요약

본 연구는 종양 미세환경(Tumor Microenvironment) 내 Tumor Infiltrating Leukocytes (TILs)의 풍부함을 정량화할 수 있는 신뢰도 높은 gene expression marker genes를 도출하는 것을 목표로 했다. 기존 문헌에서 purified immune cells 기반으로 보고된 candidate marker genes가 실제 tumor samples에서도 유효한지 검증하기 위해, The Cancer Genome Atlas (TCGA)의 9986개 샘플을 대상으로 새로운 pairwise similarity statistic을 적용하여 co-expression 패턴을 분석했다. 그 결과, 14종의 immune cell populations을 측정할 수 있는 60개의 high confidence marker genes를 최종 선정했으며, 이는 flow cytometry 및 immunohistochemistry (IHC) 결과와 높은 일치도를 보였다. 특히 FFPE tissue에서 추출한 RNA의 replicate runs에서도 우수한 재현성을 보였으며, immunotherapy dataset에서 치료 초기 responder와 non-responder를 구분하는 데 활용되었다. 이 연구는 기존 문헌 기반 마커의 한계를 지적하고, 종양 데이터에 최적화된 concise gene set을 제공함으로써 immune oncology 연구 및 임상 시험에서의 TILs 분석 표준화를 지원한다.

방법

Study design과 데이터 소스 연구 설계는 computational analysis로, 문헌 기반 candidate marker genes (exhausted CD8 cells, FOXP3 for Tregs 포함)를 TCGA의 9986개 tumor gene expression samples에 적용하여 평가했다. TCGA Level 3 RSEM-normalized RNASeqV2 data를 사용했으며, 분석 전 log2-transformed 처리만 수행하고 추가적인 preprocessing은 적용하지 않았다. 또한, validation을 위해 ovarian cancer patients data와 immunotherapy dataset을 활용했다. NanoString nCounter PanCancer Immune Profiling panel을 사용하여 PBMC lysates (~60,000 cells per assay) 및 FFPE tumor biopsy sections (150–300 ng per assay)의 gene expression을 측정했으며, 40개 reference genes 중 geNorm으로 결정된 best subset을 사용하여 normalization을 수행했다.

Marker gene 선정 절차 및 통계적 방법 기존 Pearson correlation을 변형한 pairwise similarity statistic을 개발하여, 두 gene이 동일한 cell type의 abundance에 의해 조절될 때 기대되는 co-expression 패턴 (slope of 1, high correlation)을 정량화했다. 이 통계량은 log-transformed expression values 간의 상관관계와 기울기가 1에 가까운지를 측정하며, 값이 1일 때 perfect correlation with slope of 1을 의미한다. TCGA의 24개 RNA-Seq datasets에서 모든 candidate marker gene pairs 간 pairwise similarity statistic을 계산하고, 각 pair의 평균 유사도를 기반으로 similarity matrix를 구성했다. Hierarchical clustering을 통해 높은 co-expression pattern (>0.6 또는 >0.4 threshold)을 보이는 gene subset을 선별했으며, domain knowledge를 적용하여 다른 cell type에서도 발현되는 것으로 알려진 genes (예: FLT3LG, GZMM in CD8 T cells; BIRC5 등 in Th2 cells)는 제외했다. 최종적으로 선정된 marker genes의 log-transformed expression values의 simple average로 cell type scores를 계산했으며, Total TILs score는 PTRPC (CD45)와의 correlation이 0.6을 초과하는 cell scores의 평균으로 정의되었다. Cell type enrichment scores는 Total TILs score에 대한 linear regression residuals로 계산되어, 총 TILs 수준에 상대적인 각 cell population의 abundance or depletion을 측정했다.

Validation 및 Reproducibility 분석 도출된 immune cell scores의 타당성을 검증하기 위해 flow cytometry 및 IHC 측정값과의 concordance를 Pearson correlation과 Root Mean Squared Error (RMSE)로 평가했다. Flow cytometry는 BD LSR II machine을 사용하여 12-color antibody staining panels (PBMC subset panel, T cell subset panel)로 수행했으며, absolute numbers 및 activation states (naïve-memory-effector subsets)를 측정했다. Reproducibility 분석에서는 R package lme4를 사용하여 linear mixed model을 적합화(sample ID를 random effect로 설정)하여, 총 분산 중 noise에 의한 residual variance의 비율을 계산함으로써 기술적 변이도를 정량화했다.

주요 결과

Marker gene 선정 및 Co-expression 패턴 문헌 기반 candidate genes 중 60개의 marker genes가 최종 선정되어 14종의 immune cell populations (B-cells, T-cells, NK cells, Macrophages, Dendritic cells, Mast cells, Tregs, Th1, Th2, CD8+ T cells, Exhausted CD8+ T cells 등)을 정량화하는 데 사용되었다. TCGA 데이터 분석 결과, 기존 문헌에서 single cell type에 풍부하게 발현된다고 보고된 genes의 상당수가 실제 tumor microenvironment에서의 co-expression patterns와 일치하지 않아 false positive로 걸러짐을 확인했다. 예를 들어, B-cell candidate genes 26개 중 CD19, BLK 등은 높은 pairwise similarity (>0.7)를 보였으나, BLNK는 CD19와 uncorrelated하여 제외되었다. T-cell markers는 매우 강한 marker-like co-expression을 보인 반면, T-helper cell markers는 상대적으로 약한 패턴을 보였다. 평균 pairwise similarity score threshold 0.4 미만인 cell types (예: Normal Mucosa)는 제외되었다.

Validation 결과: Flow Cytometry 및 IHC와의 Concordance 도출된 cell type scores는 flow cytometry 및 IHC 판독값과 높은 concordance를 보였다. Ovarian cancer patients data에서 NanoString 기반 cell scores와 flow cytometry/IHC 측정값 간의 Pearson correlation은 유의미하게 높았으며, RMSE는 낮게 유지되었다. 이는 gene expression profiling이 기존 gold standard인 flow cytometry 및 IHC와 비교할 때 clinically practical workflow에서도 신뢰할 수 있는 결과를 제공함을 시사한다. 특히, FFPE tissue에서 추출한 replicate RNA samples에서 cell scores는 기존 IHC readings보다 훨씬 우수한 reproducibility를 기록했다. Linear mixed model 분석 결과, residual variance (noise)의 비율이 낮아 기술적 변이가 최소화됨을 확인했다.

Clinical Utility: Immunotherapy Response Prediction Immunotherapy dataset 분석에서, 도출된 marker genes 기반 cell scores는 치료 초기 단계에서 responder와 non-responder를 명확히 구분하는 데 성공했다. Checkpoint inhibition therapy에 대한 immune response의 intricate picture를 제공했으며, 특히 TILs composition의 변화가 치료 반응과 연관됨을 보였다. Total TILs score 및 특정 cell type enrichment scores (예: CD8+ T cells, Exhausted CD8+ T cells)는 treatment efficacy 예측에 유용한 biomarker로 작용했다.

통계 분석

분석 설계 — 이 연구는 기존 문헌에서 보고된 면역 세포 마커 유전자가 실제 종양 미세환경(Tumor Microenvironment) 내에서도 유효한지 검증하기 위해 수행되었다. 연구자는 The Cancer Genome Atlas (TCGA)의 32개 암종, 총 9986개의 RNA-Seq 샘플을 데이터 소스로 사용했다. 주요 목적은 문헌 기반 후보 유전자 목록을 평가하여, 종양 조직 내에서 특정 면역 세포 집단의 풍부도(abundance)를 정량화할 수 있는 고신뢰성 마커 유전자 서브셋(최종 60개 유전자, 14개 세포 집단)을 도출하는 것이었다. Primary endpoint는 문헌 기반 마커 유전자의 co-expression 패턴이 종양 데이터에서 일관성을 보이는지 확인하고, 이를 통해 계산된 Cell type scores가 Flow cytometry 및 Immunohistochemistry (IHC) 결과와 일치(concordant)하는지 검증하는 것이다.

무엇을 위해 어떤 분석을 썼는가 — 연구자는 문헌에서 도출된 후보 마커 유전자들이 종양 데이터 내에서 진정한 세포 유형 특이성을 보이는지 평가하기 위해 새로운 통계 도구인 Pairwise similarity statistic을 개발하고 적용했다. 이 지표는 두 유전자의 log-transformed expression 값 간의 상관관계와 기울기(slope)가 1에 가까운지를 측정하여, 유전자들이 동일한 세포 집단의 풍부도에 의해 동조적으로 조절되는지 판단한다. 이를 위해 TCGA의 24개 RNA-Seq 데이터셋에서 모든 후보 유전자 쌍 간 유사도를 계산하고, 계층적 클러스터링(Hierarchical clustering)을 통해 높은 co-expression 패턴을 보이는 유전자 군집을 선별했다. 또한, 도출된 Cell type scores의 타당성을 검증하기 위해 Flow cytometry 및 IHC 측정값과의 일치도를 Pearson correlation과 Root Mean Squared Error (RMSE)로 평가했다. 재현성(Reproducibility) 분석에서는 R package lme4를 사용하여 Linear mixed model을 적합화(sample ID를 random effect로 설정)하여, 총 분산 중 noise에 의한 잔차 분산(residual variance)의 비율을 계산함으로써 기술적 변이도를 정량화했다. 마지막으로, TCGA 데이터에서 각 세포 집단의 상대적 풍부도를 분석하기 위해 Total TILs score를 기준으로 Simple linear regression을 수행하고, 그 잔차(residuals)를 Cell type enrichment score로 정의하여 해석했다.

방법론 평가 — 이 연구의 통계 처리에서 잘 된 점은 대규모 공개 데이터셋(TCGA, n=9986)을 활용하여 마커 유전자의 robustness를 검증했다는 점과, 단순 상관관계(Pearson correlation)만으로는 부족할 수 있는 '기울기(slope)'까지 고려한 Pairwise similarity statistic을 도입하여 false positive 마커를 효과적으로 걸러냈다는 점이다. 또한, Flow cytometry와 IHC라는 gold standard 방법론과의 비교를 통해 외부 검증(external validation)의 일부를 수행했고, FFPE 샘플에서의 재현성을 Linear mixed model로 정량화하여 기술적 신뢰도를 입증했다. 그러나 의심스러운 점은 결측치(Missing data) 처리 방법이 명시되지 않았다는 것이다. TCGA 데이터는 결측치가 많을 수 있으므로, 이를 어떻게 보정하거나 제외했는지의 투명성이 부족하다. 또한, Multiple testing correction이 수행되었는지 원문에 명시되지 않았다. 60개 유전자와 14개 세포 집단을 평가하는 과정에서 다중 비교 오류(Type I error)가 발생할 가능성이 있으나, 이에 대한 보정(예: FDR control) 언급이 없다. 마지막으로, Linear regression을 이용한 Enrichment score 계산 시 모델 가정(선형성, 잔차의 정규성 등)에 대한 진단(diagnostic check) 결과가 제시되지 않았다.

설계에 참고할 점 — 유사한 연구를 설계할 때는 이 논문처럼 대규모 공개 데이터셋(TCGA 등)을 활용하여 후보 biomarker의 co-expression 패턴을 사전 검증하는 접근법을 채택할 수 있다. 특히, 단순 상관관계가 아닌 slope를 고려한 지표나 Mixed model을 이용한 재현성 분석은 기술적 변이를 통제하는 데 유용하므로 참고할 만하다. 반면, 결측치 처리 전략과 다중 비교 보정(Multiple testing correction) 방법을 연구 설계 단계에서 명확히 정의하고 보고해야 하며, 회귀 모델 적용 시 가정 검증(Assumption checking) 과정을 포함하여 결과의 통계적 엄밀성을 높여야 한다.

강점

본 연구의 가장 큰 강점은 대규모 public dataset (TCGA, 9986 samples, 32 tumor types)을 활용하여 문헌 기반 candidate marker genes의 실제 tumor microenvironment 내 유효성을 엄격하게 검증했다는 점이다. 기존 Pearson correlation만으로는 설명되지 않는 slope deviation 문제를 해결하기 위해 novel pairwise similarity statistic을 개발하고 적용함으로써, false positive marker genes를 효과적으로 제거할 수 있었다. 또한, flow cytometry 및 IHC라는 gold standard와의 직접적인 비교를 통해 도출된 cell type scores의 clinical validity를 입증했으며, FFPE tissue에서의 높은 reproducibility는 임상 샘플 분석에 대한 실용성을 크게 높였다. 마지막으로, concise gene set (60 genes)과 computational simplicity (simple average of log-expression)는 기존 복잡한 deconvolution algorithms 대비 해석의 용이성과 구현의 편의성을 제공한다.

한계

본 연구에서 도출된 cell type scores는 absolute quantification을 제공하지 않으며, 상대적 abundance만 측정할 수 있다는 점이 방법론적 제약이다. 즉, "500개의 CD8 cells"와 같은 절대 수치를 직접 산출할 수 없으며, calibration exercise (reference sample measurement)가 필요하다. 또한, 일부 cell types (예: T-helper cells, NK cells)의 marker genes는 상대적으로 약한 co-expression pattern을 보여, 측정 오차나 intra-cellular variability로 인해 정확도가 낮을 수 있다. 연구 데이터의 대부분이 TCGA bulk RNA-seq data에 기반하고 있어, single-cell resolution의 세부적인 immune cell heterogeneity를 완전히 반영하지 못할 가능성이 있다. 마지막으로, validation cohort가 주로 ovarian cancer 및 특정 immunotherapy dataset에 한정되어 있어, 다른 tumor types에서의 generalizability는 추가 검증이 필요할 수 있다.

해석

이 연구는 TILs profiling을 위한 robust gene expression signature를 제공함으로써, immune oncology 분야에서 bulk tissue samples의 활용도를 높이는 데 기여한다. 기존 flow cytometry/IHC의 한계 (sample constraints, FFPE incompatibility)를 극복하면서도 높은 concordance와 reproducibility를 확보했으므로, 대규모 cohort studies 및 clinical trials에서 TILs composition을 정량화하는 표준 도구로 채택될 수 있다. 특히, immunotherapy response prediction에 early discrimination capability를 보인 점은 personalized medicine 접근에서 checkpoint inhibitors의 efficacy monitoring biomarker로서의 잠재력을 시사한다. LLM Wiki의 oncology/imaging/pulmonology/AI 문헌들과 연계할 때, 이 marker genes는 tumor microenvironment의 immune landscape를 해석하는 computational framework의 핵심 입력값으로 활용될 수 있으며, 향후 multi-omics integration (genomics, proteomics, imaging) 연구에서 TILs 관련 endpoint와의 상관관계 분석에 기초 자료로 사용될 것이다.