Targeted Sequencing Analysis of Pulmonary Adenocarcinoma with Multiple Synchronous Ground-GlassLepidic Nodules

authors

Park et al.

journal

Journal of Thoracic Oncology

year

2018

doi

10.1016/j.jtho.2018.07.097

category

clinical-oncology

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업데이트

2026-10-11

요약

이 연구는 다발성 동시성 폐암(Multiple Synchronous Lung Cancers, MSLCs)에서 관찰되는 Ground-Glass/Lepidic (GG/L) 결절과 침습성 Adenocarcinoma (ADC)의 유전적 독립성을 확인하기 위해 수행되었다. 16명의 환자로부터 채취된 Atypical Adenomatous Hyperplasia (AAH), Adenocarcinoma in situ (AIS), Minimally Invasive Adenocarcinoma (MIA) 및 ADC 샘플에 대해 154개 암 관련 유전자를 타겟으로 하는 Next-Generation Sequencing (NGS)을 적용했다. 분석 결과, 동일한 환자 내의 다발성 병변들은 서로 다른 변이 프로파일을 보였으나, 일부에서는 EGFR 또는 KRAS와 같은 Driver gene mutation이 공유되는 것으로 나타났다. 특히 EGFR-mutant ADC를 가진 환자의 동시성 GG/L 결절에서도 EGFR 변이가 확인되었으나, EGFR wild-type ADC 환자에서는 GG/L 결절에서 EGFR 변이가 관찰되지 않았다. 또한, ADC 내 Lepidic portion과 Invasive portion 사이에는 Intratumoral heterogeneity가 존재했지만, 주요 Driver gene mutation은 균질하게 분포하는 것으로 나타났다. 이 결과는 GG/L 결절과 ADC가 유전적으로 독립적인 종양임을 시사하며, 고 Variant Allele Frequency (VAF)를 가진 Driver mutation이 침습성 병변에서 더 두드러짐을 보여준다.

방법

연구 설계는 Seoul National University Bundang Hospital에서 2013년 1월부터 2016년 12월까지 ADC로 인해 wedge resection 또는 lobectomy를 받은 환자들을 대상으로 한 관찰 연구이다. 포함 기준은 ADC와 동시성 AAH, AIS, 또는 MIA를 모두 가진 환자였으며, 수술 전 치료를 받지 않은 16명의 환자가 최종 분석에 포함되었다. 두 명의 병리학자가 독립적으로 모든 사례를 검토하고, 종양 세포 비율이 60% 이상인 영역을 microdissection하여 샘플링했다.

Genomic DNA는 Maxwell 16 Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Plus LEV DNA Purification Kit (Promega)를 사용하여 추출되었다. 타겟 부위 증폭은 Agilent SureSelect Target Enrichment protocol을 따랐으며, 154개 암 관련 유전자를 포함하는 2.9-Mbp custom capture probe가 사용되었다. 시퀀싱은 Illumina HiSeq 2500 sequencer를 사용하여 paired-end massively parallel sequencing (2 x 100 bp) 방식으로 수행되었으며, 평균 read depth는 약 2539였다. 변이 발견 및 genotype calling은 Genomon pipeline software의 default parameters로 진행되었고, exonic region의 candidate variants는 ANNOVAR software로 annotation되었다. 통계 분석 및 데이터 시각화(R package ggplot2, VennDiagram)는 R software를 사용하여 수행했다. Primary endpoint는 동시성 병변들 간의 유전적 관계 및 변이 프로파일의 비교였으며, Secondary endpoint로는 각 병변 단계(AAH, AIS, MIA, ADC)별 특정 유전자 변이 빈도 및 Lepidic/Invasive portion 간의 Intratumoral heterogeneity 분석을 포함한다.

주요 결과

16명의 환자에서 총 52개의 샘플(19개 AAH, 10개 AIS, 7개 MIA, 16개 ADC)이 분석되었다. 동일한 환자의 다발성 병변들은 대체로 서로 다른 mutation profile을 보였으나, 10명의 환자에서는 일부 병변 간에 공유된 변이가 관찰되었다. EGFR은 가장 빈번하게 공유된 유전자였으며, 전체 샘플의 36.5% (19/52)와 ADC 샘플의 75% (12/16)에서 EGFR mutation이 확인되었다. EGFR-mutant ADC를 가진 12명 중 5명은 동시성 GG/L 결절에서도 EGFR mutation을 보였으나, EGFR wild-type ADC 환자에서는 GG/L 결절에서 EGFR mutation이 전혀 관찰되지 않았다. 모든 EGFR 변이는 kinase domain에 위치했으며, 동시성 병변 간에 mutant loci가 동일하거나 상이한 경우 모두 존재했다.

각 병변 유형별 특징적인 변이 패턴은 다음과 같다. AAH에서는 LRP1B (36.8%, 7/19), KRAS (26.3%, 5/19), BRAF 및 EGFR (각 21.1%, 4/19)가 빈번하게 변이되었다. AIS에서는 MAP2K1 (40%, 4/10)과 PRKCB (30%, 3/10)이 주요 변이 유전자였다. MIA에서는 RBM10 (42.9%, 3/7), CTNNB1, EGFR, SMG1 (각 28.6%, 2/7)가 자주 관찰되었다. ADC에서는 EGFR (75%, 12/16), KMT2D (31.3%, 5/16), BRAF (25%, 4/16) 순으로 변이 빈도가 높았다. 평균 exonic mutation 수는 AAH 4.2개, AIS 5.4개, MIA 4.0개, ADC 5.4개로 나타났다. VAF가 20% 이상인 40개의 변이 중 80%는 ADC에서 식별되었으며, ADC 내 주요 driver gene (EGFR, KRAS, TP53)의 평균 VAF는 각각 22%, 41%, 41.5%였다.

ADC의 Lepidic portion과 Invasive portion을 비교한 결과(10개 샘플), Lepidic portion의 평균 변이 수는 6.0개, Invasive ADC는 5.4개였으며, 두 영역 간 변이 중복률은 평균 37.3% (range 11%-67%)였다. 10개 중 9개의 ADC 샘플에서 EGFR, KRAS, BRAF mutation은 Lepidic과 Invasive portion 모두에서 균질하게(homogeneously) 분포하는 것으로 확인되었다.

강점

이 연구는 다발성 동시성 폐암 환자에서 병리학적으로 연속적인 단계(AAH, AIS, MIA, ADC)를 가진 병변들을 체계적으로 비교 분석한 점이 강점이다. 154개 유전자를 타겟으로 한 deep sequencing (평균 read depth ~2539)을 적용하여 낮은 VAF의 변이까지 민감하게 탐지할 수 있었다. 특히, 동일한 환자 내에서 여러 단계의 병변을 동시에 시퀀싱함으로써, 종양 진행 과정에서의 clonal evolution과 independent tumorigenesis를 명확히 구분하는 데 기여했다. 또한, ADC 내부의 Lepidic와 Invasive 영역을 분리하여 Intratumoral heterogeneity를 정량적으로 분석한 것은 기존 연구 대비 방법론적 엄밀성이 높다.

한계

본 연구의 표본 크기가 작아 (n=16 patients, 52 samples) 통계적 검정력이 제한적일 수 있다. 또한, custom panel이 154개 유전자로 한정되어 있어, 전체 게놈 수준의 변이를 포괄하지 못하며, 특히 non-coding region이나 구조적 변이(Structural Variants)는 분석되지 않았다. 연구 대상이 단일 기관 (Seoul National University Bundang Hospital)에서 수집된 코호트이므로, 인종적 또는 지역적 편향 가능성이 존재한다. 또한, 전향적인 임상 결과 데이터 (예: Overall Survival, Progression-Free Survival)와의 연관성 분석이 포함되지 않아, 유전적 발견의 직접적인 임상 예후 의미는 추론에 의존해야 한다.

해석

이 연구 결과는 다발성 GG/L 결절과 ADC가 대부분 유전적으로 독립적인 종양임을 지지하며, 이는 TNM 분류 제8판에서 GG/L nodules를 별도 질환 실체로 분류한 근거와 일치한다. 그러나 일부 환자에서 EGFR 또는 KRAS mutation이 공유되는 현상은, 특정 유전자나 경로에서의 선택 압력 (selection constraints)이나 초기 carcinogenesis 단계에서의 공통 기원을 시사한다. 특히, Driver gene mutation의 VAF가 병변의 침습성 증가와 함께 높아지는 경향은, driver mutation이 종양 성장과 공간적 확장에 핵심적인 역할을 함을 보여준다. 이 발견은 LLM Wiki의 oncology 및 molecular pathology 문헌에서, 다발성 폐암의 치료 전략 (예: EGFR-TKI 적용 여부)을 결정할 때 각 병변의 개별 유전체 분석 필요성을 강조하는 근거로 활용될 수 있다. 또한, Intratumoral heterogeneity가 존재함에도 driver mutation이 균질하게 분포한다는 점은, biopsy 샘플링 오류에 대한 우려를 일부 해소하고 representative sampling의 중요성을 재확인시킨다.